Novo “motor de evolução” cria superproteínas 100.000 vezes mais rápido

“Isso é como dar um botão de avanço rápido à evolução”, diz o coautor sénior Pete Schultz, Presidente e CEO do Scripps Research, onde também ocupa a Cadeira Presidencial L.S. “Sam” Skaggs. “Agora você pode evoluir proteínas continuamente e de forma precisa dentro das células sem danificar o genoma celular ou exigir etapas laboriosas.”

A evolução dirigida é um processo de laboratório que envolve a introdução de mutações e a seleção de variantes com funções aprimoradas ao longo de múltiplos ciclos. É utilizada para moldar proteínas com propriedades desejadas, como anticorpos altamente seletivos e de alta afinidade, enzimas com novas especificidades ou propriedades catalíticas, ou para investigar a emergência de mutações de resistência em alvos de medicamentos. No entanto, os métodos tradicionais muitas vezes exigem rodadas repetidas de manipulação de DNA e testes, com cada ciclo levando uma semana ou mais. Sistemas de evolução contínua — onde as proteínas evoluem dentro de células vivas sem intervenção manual — visam agilizar esse processo, permitindo mutação e seleção simultâneas a cada divisão celular (cerca de 20 minutos para bactérias). Mas abordagens existentes foram limitadas por complexidade técnica ou por taxas de mutação modestas.

O T7-ORACLE contorna esses gargalos ao projetar bactérias de E. coli — um organismo modelo padrão em biologia molecular — para hospedar um segundo sistema de replicação de DNA artificial derivado do bacteriófago T7, um vírus que infecta bactérias e tem sido amplamente estudado por seu sistema de replicação simples e eficiente. O T7-ORACLE permite hypermutação contínua e evolução acelerada de biomacromoléculas, sendo projetado para ser amplamente aplicável a muitos alvos proteicos e desafios biológicos. Conceitualmente, o T7-ORACLE se baseia e estende os esforços em sistemas de replicação ortogonais existentes — ou seja, que operam separadamente da maquinaria celular — como o OrthoRep em Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro) e EcORep em E. coli. Em comparação com esses sistemas, o T7-ORACLE se beneficia da combinação de elevada mutagênese, rápido crescimento, alta eficiência de transformação e da facilidade com que tanto o hospedeiro E. coli quanto o plasmídeo replicon circular podem ser integrados em fluxos de trabalho padrão de biologia molecular.

O sistema ortogonal T-7 ORACLE visa apenas o DNA plasmidial (pequenas, circulares peças de material genético), mantendo o genoma do hospedeiro celular intacto. Ao projetar a DNA polimerase T7 (uma enzima viral que replica DNA) para ser propensa a erros, os pesquisadores introduziram mutações em genes-alvo a uma taxa 100.000 vezes maior do que o normal, sem danificar as células hospedeiras.

“Este sistema representa um grande avanço na evolução contínua”, afirma o coautor sénior Christian Diercks, professor assistente de química no Scripps Research. “Em vez de uma rodada de evolução por semana, você obtém uma rodada a cada vez que a célula divide — então realmente acelera o processo.”

Para demonstrar o poder do T7-ORACLE, a equipe de pesquisa inseriu um gene comum de resistência a antibióticos, a TEM-1 β-lactamase, no sistema e expôs as células de E. coli a doses crescentes de vários antibióticos. Em menos de uma semana, o sistema evoluiu versões da enzima que puderam resistir a níveis de antibióticos até 5.000 vezes superiores ao original. Essa prova de conceito demonstrou não apenas a velocidade e precisão do T7-ORACLE, mas também a sua relevância no mundo real ao replicar como a resistência se desenvolve em resposta a antibióticos.

“A parte surpreendente foi quão de perto as mutações que observamos corresponderam a mutações de resistência do mundo real encontradas em configurações clínicas”, observa Diercks. “Em alguns casos, vimos novas combinações que funcionaram ainda melhor do que aquelas que você veria em uma clínica.”

No entanto, Diercks enfatiza que o estudo não se concentra na resistência a antibióticos em si.

“Este não é um artigo sobre TEM-1 β-lactamase”, ele explica. “Esse gene foi apenas um marco bem caracterizado para mostrar como o sistema funciona. O que importa é que agora podemos evoluir virtualmente qualquer proteína, como alvos de fármacos contra câncer e enzimas terapêuticas, em dias ao invés de meses.”

O potencial mais amplo do T7-ORACLE reside na sua adaptabilidade como uma plataforma para engenharia de proteínas. Embora o sistema esteja embutido em E. coli, a bactéria serve principalmente como um vaso para evolução contínua. Os cientistas podem inserir genes de humanos, vírus ou outras fontes em plasmídeos, que são então introduzidos nas células de E. coli. O T7-ORACLE muta esses genes, gerando proteínas variantes que podem ser avaliadas ou selecionadas para função aprimorada. Como E. coli é fácil de cultivar e amplamente utilizada em laboratórios, fornece um sistema conveniente e escalável para evoluir virtualmente qualquer proteína de interesse.

Isso pode ajudar os cientistas a evoluir mais rapidamente anticorpos para direcionar cânceres específicos, evoluir enzimas terapêuticas mais eficazes e projetar proteases que visem proteínas envolvidas no câncer e em doenças neurodegenerativas.

“O que é empolgante é que não se limita a uma doença ou a um tipo de proteína”, diz Diercks. “Como o sistema é personalizável, você pode inserir qualquer gene e evoluí-lo para qualquer função que precisar.”

Além disso, o T7-ORACLE funciona com culturas padrão de E. coli e fluxos de trabalho laboratoriais amplamente utilizados, evitando os protocolos complexos exigidos por outros sistemas de evolução contínua.

“A principal coisa que diferencia isso é quão fácil é implementar”, acrescenta Diercks. “Não há necessidade de equipamentos ou especialização específicos. Se você já trabalha com E. coli, provavelmente poderá usar este sistema com ajustes mínimos.”

O T7-ORACLE reflete o objetivo mais amplo de Schultz: reconstruir processos biológicos-chave — como replicação de DNA, transcrição de RNA e tradução de proteínas — para que funcionem independentemente da célula anfitriã. Essa separação permite que os cientistas reprogramem esses processos sem interromper a atividade celular normal. Ao desacoplar processos fundamentais do genoma, ferramentas como o T7-ORACLE ajudam a avançar a biologia sintética.

“No futuro, estamos interessados em usar este sistema para evoluir polimerases que possam replicar ácidos nucleicos totalmente não naturais: moléculas sintéticas que se assemelham ao DNA e RNA, mas com propriedades químicas novas,” diz Diercks. “Isso abriria possibilidades em genômica sintética que estamos apenas começando a explorar.”

Atualmente, a equipe de pesquisa está focada em evoluir enzimas derivadas de humanos para uso terapêutico e em adaptar proteases para reconhecer sequências de proteínas relacionadas ao câncer.

“A abordagem T7-ORACLE combina o melhor de ambos os mundos,” diz Schultz. “Agora podemos combinar o design racional de proteínas com evolução contínua para descobrir moléculas funcionais de forma mais eficiente do que nunca.”

Além de Diercks e Schultz, os autores do estudo, “Um replisoma T7 ortogonal para hypermutação contínua e evolução acelerada em E. coli,” incluem Philipp Sondermann, Cynthia Rong, Thomas G. Gillis, Yahui Ban, Celine Wang e David A. Dik do Scripps Research.

Este trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (subvenção RGM145323A).